Entwiicklung lymphozytärer Subpopulationen bei Tumorpatienten nach subkutaner Applikation von Mistelextrakten

A. Bussing (a) - A. Rosenberger (b) - C. Stumpf  (c) - M. Schietzel (c)

a. Abteilung für angewandte Inmunologie, Krebsforschung Herdecke, Universität Witten/Herdecke, Gemeinschaftskrankenhaus Herdecke.

b. Institut für Medizinische Informationsverabeitung, Universität Tübingen

c. Tumor-Ambulanz, Gemeinschaftskrankenhaus Herdecke.

Schlüsselwörter 

Tumor - Patienten - Misteltherapie - Lymphozyten - Subpopulationen 

Zusammenfassung 

Fragestellung: Es soilte überprüft werden, ob die subkutane Misteltherapie in üblicher Dosissteigerung zur Immunsuppression oder immunstimulation, ausgedrückt als signifikante Reduktion oder Vermehrung definierter Populationen, führt. Patienten und Methoden: Hierzu wurden 23 Tumorpatienten mit unterschiedlichen Tumorentitäten subkutan mit einem wässrigen Mistelextrakt (Helixor) behandelt. Über einen Zeitraum von 7 Monaten nach Therapiebeginn wurden die peripheren Lymphozyten durchflusszytometrisch differenziert. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Im Beobachtungszeitraum kam es zur anteilmässigen Vermehrung der Lymphozyten und zum zahlenmässigen Anstieg der natürlichen Killer(NK)-Zellen. Für die Anzahl lymphozytärer Subpopulationen (CD19+ B-Zellen, CD4+ T-Helfer/ Induktor-Lymphozyten, CD8+ CD28- suppressorische Zellen, CD8+ CD28+ zytotoxische Zellen) und den Anteil CD25+ (aktivierter) T-Zellen zeigte sich zudem ein statistisch auffälliiger Trend, der aufgrund des multiplen Testproblems der Statistik jedoch nicht als signifikant bewertet werden konnte. Für die Anzahl der Leukozyten fiel hingegen ein nichtsignifikantes Abfalien nach Therapiebeginn auf. Die aus früheren Beobachtungen resultierende Annahme, dass es 2-3 Monate nach Therapiebeginn zu einer Vermehrung definierter T-Zell-Subpopulationen kommt, konnte auf Basis der vorliegenden. Daten statistisch nicht bewiesen werden. Dennoch zeigte sich eine statistisch auffällige Häufigkeitsverteilung der Maximal-Monate für CD19+ B-Zellen, CD4+ T-Zellen, CD8+ Zellen, CD8+ CD28+ zytotoxische Zellen und CD16+/CD56+ NK-Zellen, was auf die Richtigkeit der Annahme hinweist. Mit Ausnahme der Leukozytenzahi konnten also nur positive Veränderungen der Immunparameter festgestelit werden. Die Reaktionen zeigten allerdings deufliche interindividuelle Unterschiede im Ansprechen auf den Extrakt, wobei auch Dosissteígerungen >3 ng Mistellektin (bezogen auf Gesamtextrakt) pro kg Kbrpergewicht zu Vermehrungen der CD4+ T-Helfer/Induktor-Zellen und nicht zur Immunsupipression führten. Ein eingeschränktes immunologisches Ansprechen auf die Extrakte war insbesondere bei Patienten mit verminderter Anzahl peripherer T-Zellen zu beobachten, während Patienten mit normaler T-Zell-Zahl reagibler waren.

Key Words

Tumour patients - Mistletoe therapy - Lymphocyte subsets

Summary

Lymphocye Subsets in Tumour Patients during Subcutaneous Mistíetoe Therapy

Objective: In order to exclude the possibility that mistletoe therapy may result in immunosuppression, as indicated by a significant reduction of defined lymphocyte subsets, Patients and Methods: peripheral blood cells of 23 tumour patients were treated subcutaneously with increasing concentrations of aqueous mistletoe extracts (Helixor). Results and Conclusions: Within an observation period of 7 months, the relative amount of lymphocytes and the number of natural killer (NK) cells increased while the number of lymphocyte subsets (i.e. CD19+ B cells, CD4+ T helper cells, CD8+ CD28- suppressor cells, CD8+ CD28-cytotoxic cells) and the proportion of CD25+ (activated) cells within T cells showed a statistically remarkable trend; due to the multiple test problem of statistical evaluation this trend is not allowed to be termed signíficant. The leucocytes decreased insignificantly within the observation period. However, we were unable to verify a suggested increase of defined lymphocyte subsets within 2-3 months after the onset of mistletoe treatment. Nevertheless, for the parameters CD19+ B cells, CD4+ T helper cells, CD8+ cells, CD8+ CD28+ cytotoxic cells and CD16+/CD56+ NK cells we observed statistically remarkable peaks within die 2nd and 3rd month of therapy, confirming the hypothesis. The responses to the extracts were obviously interindividually different; the immune responses especially of patients with a lower number of peripheral T cells were less significant as compared to those of patients with adequate T cell numbers. Surprisingly, even an increase of the drug concentration >3 ng mistletoe lectin (as determined within the whole plant extract) per kg body weight enhanced the number of CD4+ T helper cells. A decreased immunological reaction on mistletoe extracts was shown especially for patients with a reduced number of peripheral T cells, whereas patients with normal T-cell number were more reactive.

Enleitung

Die augenfälligste Wirkung von Extrakten aus Viscum album L. (VAL) ist ihre ausgeprägte Zytotoxizität gegenüber Tümorzellen, aber auch gegenüber humanen Fibroblasten und Lymphozyten. Diese ist vornehmlich bedingt durch die Induktion des Mistellektin(ML)-induzierten apoptotischen Zelltods [Übersicht in 1, 21 bzw. durch eine Viscotoxin-indwierte Membranaffektion mit nachfolgendem Azidentellen (nekrotischen) Zelltod [3, 41. Ausgehend von den Arbeiten Seegers [51 war zu vermuten, dass die biologischen Wirkungen von VAL nicht alleine durch ihre zytotoxische Potenz zu definieren sind, sondern dass die Applikation von VAL auch zur Aktivierung des Immunsystems führt [6-91. Dass Mistelextrakte bzw. definierte Inhaltsstoffe sowohl das unspezifische als auch das spezifische Immunsystem stimulieren. ist hinlänglich belegt [Übersicht in 101. Als biologisch relevante Inhaltsstoffe wurden hier die NIL [11-231, die Alkaloide [24-261, Rhamnogalakturonan [27-301, ein 5-kDa-Peptid [31-351, die Vesike1 [36, 371, die Viscotoxine [38, 39] und ein bisher nicht näher chat-Aterisiertes Antigen [40, 41] aus VAL genannt.

Nach subkutaner Gabe von VAL-Extrakten lassen sich verschiedene Reaktionen beobachten, die zwar Ausdruck einer Wit-kung der Extrakte sind, aber nicht gleichbedeutend mit dem Nachweis einer Wirksamkeit sein müssen. Hierbei kornrnt es zur Freisetzung von Akutphase-Proteinen, Stimulation des zellulären Immunsystems mit Zytokin- und fi-Endorphin-Freisetzung und Induktion von Anti-ML-Antikörpern [Übersicht in 17, 42-44]. Die immunologischen Reaktionen auf VAL sind jedoch individuell verschieden [45, 46] und prinzipiell nicht vorhersehbar. Darílber hinaus lassen sich nach In-vitro-Stimulation mit NIL-I, ML-II und NIL-III experimentell ausgeprägte interindividuelle Unterschiede im Ausmass der natürlichen Killer(NK)-Aktivität: der Leukozvtcn von Tumorpatienten [471 und auch dosisabhängige Unterschiede in der monozytären Freisetzung von Tumor-Nekrose-Faktor-a [48] finden.

(Prä-)Klinische Daten zur Entwicklung lymphozytärer- Subpopulationen von Tumorpatienten nach subkutaner VAL-Injektion beziehen sich zurneist auf einen Beobachtungszeitraum von wertígen Stunden [19-221 bzw. 2- bzw. 3-Punkt-Messungen nach 4- bzw. 12wöchiger Tberapiedauer [11-16, 231. Hierbei wurde eine definierte. konstante NIL-1-Konzentration (1 ng/kg KG) in cinem Mistelextrakt verabreicht. In der Praxis erfolgt die Dosier-ung jedoch meist nicht nach dem ML-Gehalt, sondem nach der individuellen Patientenreaktion (z. B. LokaIreaktion, Temperaturanstieg), die irrí Verlauf einer allmählichen Dosissteigerung auftritt. Dabei werden oft höhere Konzentrationen als 1 ng/kg KG erreicht. Zum Nachweis eines längerfristigen Anstiegs definierter Immunparameter sowie zum Ausschluss einer Iminunsuppression unter einem solchen Vorgehen wurden periphere Lymphozyten von Turnorpatienten, die nicht:fermentierte VAL-Extrakte-(Helixor") subkutan injiziert bekarnen, über einen Zeitraum von 7 Monaten durchflusszytornetrisch verfolgt.

Der vorliegenden Arbeit lag die Fragestellung zugrunde, ob eine subkutane Misteltherapie mit allmählicher Dosissteigerung bis zur Lokal- oder Temperaturreaktion die Lymphozyten des peripheren Blutes von Turnorpatienten beeinflusst.

Tab. 1. Patientenbeschreibung und Dosis

Patient	Diagnose	CD4+T-Zellen/ul	Wirtsbaum	Monatliche Dosiseskalation, mg Pro Injektion; 2X wöchentlich
				0	1	2	3	4	5	6	7
UB/m/1939	Hypernephrom	933	P	1	5	10	10	20	20	30	30
EB/w/1951	Sigma-Karzinom	1107	M	3	2,5	5	10	20	30	50	100
PB/w/1955	Mammakarzinom	1451	A	1	1	1	5	5	5	5	5
HC/m/1937	Sigma-Karzinom	887	A	3	7,5	20*	30*	50*	50*	50*	50
HE/m/1959	Melanom	893	P-A	1	0,01	0,01	0,005	//1
MH/m/1930	Hypernephrom	640	P	3	1	5	5	5	15	15	20
FH/m/1966	Melanom	531	P	1	0,5	1	1	2,5	2,5	2,5	5
DH/m/1938	Leiomyosarkom	826	P	5	20	20	//2
LK/w/1932	metastasiertes Kolokarzinom	474	M	4	4	4	4	4	4*	4*	4*
HK/m/1943	Immunzytom	783	A	1	5	5	10	//3
IK/w/1925	Mammakarzinom	323	M	3	10	10	//2
WK/w/1936	Mammakarzinom	359	M	1	3,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
WL/w/1940	Melanom	796	P	1	0,1	0,1	0,1	0,5	0,5	0,5	0,5
IM/w/1940	Mammakarzinom	373	M-P	3	0,5	0,1	0,1	0,1	1	0,75	1
GM/w/1964	Schilddrüsenkarzinom	605	M	3	2,5	2,5	2,5	5	10	10	10
BM/w/1944	Sigma-Karzinom	1426	M	3	3,5	10	17,5	20	25	30	50
IP/w/1926	Bronchialkarzinom	235	M	1	1	21,4	35,7	100	100	//4
MR/w/1951	Mammakarzinom	680	A	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
MS/w/1937	Mammakarzinom	861	M	1	1	1	2,5	2,5	2,5	3,7	5
ES/w/1939	Melanom	586	P	0,1	0,1	1	1	1	1	1	1
MT/w/1947	Cervixkarzinom	723	P	1	1	1	5	5	5	5	5
EV/w/1947	Mammakarzinom		P	1	1	1	1	1	1	1	1
GV/m/1934	metastasiertes Kolokarzinom		P	1	5	5	5	5	5	5	5

Tab. 2a. Lymphozytärer Subpopulationen von 23 Tumorpatienten

Monat	Leukozyten Zellen/ul		Lymphozyten Zellen/ul		Lymphozyten % der Leukozyten		CD3 + T-Zellen/ut		CD16+/CD56+ NK-Zellen		CD19+B-Zellen/ul
	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD
0	5683	1420	1690	649	30,4	10,5	1203	551	202	98	221	143
2	5913	1548	1732	720	30,3	11,9	1236	582	241	157	226	156
3	5707	1592	1820	841	31,7	10,4	1313	743	212	112	235	164
4	5700	1587	1635	588	29,5	9,6	1176	529	185	96	183	105
5	5516	1314	1617	533	29,7	8,7	1022	535	218	78	176	119
6	5281	1145	1641	584	31,0	7,8	1164	490	213	70	188	134
7	5714	994	1710	515	31,1	9,9	1214	439	211	84	195	133
SD = Standardabweichung

Tab. 2b. Lymphozytärer Subpopulationen von 23 Tumorpatienten

Monat	CD4+T-Zellen/u		CD8+Zellen/ul		CD4/CD8 Zellen/ul		CD8+ CD28+ Zellen/ul		CD8+ CD28- Zellen/ul		%CD25+ in CD3+T-Zellen/ul		%HLA -DR + in CD3+ T-Zellen/ul
	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD	Mittelwert	SD
0	726	319	509	389	1,87	0,87	197	99	312	338	14,6	7,2	7,3	4,4
2	779	372	507	396	1,85	0,87	189	110	320	331	14,8	6,6	7,0	3,1
3	805	351	544	531	1,92	0,82	208	96	328	452	15,0	5,6	7,4	4,0
4	713	277	498	372	1,82	0,83	189	88	307	312	13,5	4,4	7,3	3,7
5	717	370	447	207	1,76	0,78	180	85	266	163	13,1	3,8	7,6	5,3
6	729	366	478	203	1,69	0,89	193	95	284	158	13,3	4,9	6,5	3,2
7	817	323	454	196	2,03	0,94	210	107	242	121	16,0	5,9	5,0	2,4
SD =  Standardabweichung

 

Tab. 3a. Relative Werte (relativ zum Ausgangswert in Monat(0)lymphozytärer Subpopulationen von 23 Tumorpatienten

Tab. 3b. Relative Werte (relativ zum Ausgangswert in Monat(0)lymphozytärer Subpopulationen von 23 Tumorpatienten

Patienten und Methoden

Patienten und Therapie

23 Tumor-Patienten unter Misteltherapie (Helixor) wurden nach Aufklärung und Einwilligung der Patienten prospektiv untersucht. Bei dem verwendeten Mistelextrakt handelt es sich um ein zugelassenes Präparat. Die Anwendungsbeobachtung wurde entsprechend den ethischen Normen, wie sic in der Deklaration von Helsinki festgelegt wurden, und den Bestimmun2en des güItigen Arzneimittelgesetzes durchgeführt. Hierzu wurde jewei1s vomiittags Blut aus der Armvene entnommen (EDTA-Blut) und sofort durchf1usszytometrisch analysiert. Die klinischen Daten der Patienten, bei denen Jer Primärtumor bercits mit der üblichen Therapie behandelt worden i;ar und bei denen cine Chemotherapie oder Bestrafflung mindestens 3 Monate zurück1ag, sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Um schärfere Bedin-gungen fur die statistische Auswertung zu erzielen, wurden Patienten mit unte rschiedlich,-n Tumorentitäten und stark differierenden Basiswerten für die periphe7,-n Lymphozyten cingeschlossen. Das Durchschnittsalter der Patienten. wn Jenen 8 männlichen und 13 weiblichen Geschlechts waren, bet,-ue 54 ± 12 Jahre. Sechs Patienten hatten im peripheren Blut zwischen -200 Und 500 CD4+ T-Helfer/Induktor-Lymphozytenipil, 8 Patienten zwischen 501 L-nd 800 Zellen/pl, 6 Patienten zwischen 801 und 1000 Zellen/pl und 3 Patienze-n > 1000 Zellen/pd.

Den Patienten wurde jewei1s 2-3 x wöchentlich vormittags HelLxor subkuzan injiziert. Die eingesetzten Präparate zeichnen sich durch einen hohen Geb-31t des N-Acetyl-Galaktosamin-bindenden ML-111 aus (NIL-Gehalt Helixorl P 950 ng/mi; Helixorlo M 215 ng/ml, Helixor l~ A 260 n_elml~ ELLA). wobei

cotoxine unterhalb der Nachweisgrenze liegen "5 pt,-Iml; HP1-Q. Die subkutan verabreichte Dosis wurde nach folgendem Schema gesteigert. bis e--ne deutliche Lokalreaktion auftrat: 3x 1 rng, 3x 5 mg, 3x 10 rng. 2x 20 me. ' x 30 rng, 2x 20 mg, 2x 30 rng, 3x 50 rng. Bei sehr starken Lok-alreaktioren (Rötung >5cm, Schwellung, Druckdolenz) oder TemperaturerhöhUne >38'C wurde bis zum Abklingen der Reaktionen pausiert und cine jCNA,.-ils geringere Dosis verabreicht. Die individuell eräelte Dosis und der aus~ewähIte Wirtsbaum sind in Tabelle 1 angegeben. Bei 6 Patienten W-Urde -4ie Dosis während des Bcobachtungszeitraums auf > 20 me Helixor erhoht. ~i -, hrend bei 10 Patienten nur cine geringe Dosissteigerung (5 lo rng He[ix,,r) möglich war. Bei 2 Patienten traten schon primar schr starke Lokalreak-.--onen auf, die auch bei deutlicher Dosisreduktion wieder auszul(5~en \;aren, ~o dass cin Wechsel des Wirtsbaums versucht wurde. Bei 1 Patienten kar-,- es hier aufgrund der übermässigen Reaktionen zum Therapicabbruch.

Lymphozytendifferenzierung

Die Zellen des peripheren Bluts wurden mittels monoklonaler Antikör--e.(mAk; Coulter-Immunotech, Krefeld, Deutschiand) durchfl~tometi-,sch (EPICS XL-MCL, Coulter, Krefeld, Deutsch1and) differenziert: CD19- BLymphozyten, CD3+ T-Lymphozyten, CD4+ T-Helfer[Induktor-Lvmph<-~z%ten, CD8+ T-Suppressor-/zytotoxische Lymphozyten, CD8+ CD28+ zytotolasche Lymphozy~en, CD8+ CD28- suppressorische Lymphoz-.ien, CD16-, CD56+ NK-Zellen, CD25+ (Interleukin-2-Rezeptor-exprimier'ende) T-L,.-mphozyten, HLA-DR+ (MHC-Klasse-II-Molekül-HLA-DR-exprimieren.Je) T-Lymphozyten.

Statistik

Ausgewertet wurden die Daten von 13 Blutparametern der Patienten ira Verlauf von 7 Monaten. Die Messgrössen wurden sowohl ais absolute Werte (Zellen/W), ais auch als relative Werte (relativ zum Ausgangswert bei ~t 0) betrachtet (Tab. 2 und 3). Da davon auszugehen ist, dass jeder Pati-ent cine individuelle Verteilung der lymphozytären Subpopulationen aufwcisi

Forsch Komplementärmed 1999;6:196-204 197


(die am ehesten durch den Ausgangswert repräsentiert wird). ist die Betrachtung der relativen Werte im allgemeinen aussagekräftiger.

Mit dieser Untersuchung sollte überprüft werden, ob sich die einzelnen Messgrössen im Laufe der Zeit systematisch verändem. Die Hvpothese ist, dass die subkutane Misteltherapie nach den Helixor-Richtlinien keine Irnmunsuppression - ausgedrückt als signifikante Reduktion definierter Populationen - zur Folge hat. Es besteht jedoch die Vermutung, dass im 2. bzw. 3. Monat ein höherer Wert insbesondere für CD4+ T-Helfer,Induktor-Zellen, CD16+/CD56+ NK-Zellen und der CD19+ B-Zellen auftritt.

Die zeitlichen Verläufe wurden als Regressionsmodell aeschätzt. Dabei wurden je zwei Modellansätze berechnet. Der erste enthält nur die Zeit (den Monat) als Einflussfaktor (Modellansatz 1 ohne Indikatoren auf Monat 2 und 3), berücksichti,-t somit obige Vermutung nicht. Damit soll zunachst nur ein allgemeiner Trend (gleichmässige SteigerunglSenkun.g) der Blutparameter geschätzt werden. Der zweite Modellansatz enthält neben der Zeit auch Dummv-Variablen für den 2. und das 3. Monat als Einflussgrössen (Modellans.tz 2 mit Indikatoren auf Monat 2 und 3). Damit soilte cine (über den allgemeinen Trend hinaus-ehende) systematische Veränder-ung im 2. bzw. 3. Monat geschätzt werden. Zur Überprüfung wurde mit Hilfe eines F-Tests untersucht, ob in mindestens einem der beiden Monate cine signifikante Erhöhung der Messwerte beobachtet wurde. Dieses Vorgehen ist zur Adjustier-ung des Signifikanzniveaus notwendig. Sofem sich die Wer-te des 2. und des 3. Monats als nicht signifikant unterschiedlich erweisen, ist cine allgemeu*ie Trendschätzung (erster Modellansatz) günstiger.

Weiterhin sollte ein Test der Häufigkeit der Monate mit maximaler Messung untemornmen werden. Die Nuilhypothese, besteht dabei in der Annahme, dass in keinem Monat ein Messwert systematisch höher oder niedriger ausfäl1t. Somit müsste iin Monat mit der maximalen Messung Gleichverteilung herrschen Geder Monat wird mit gicicher Wahrscheinlichkeit als cin Maximal-Monat beobachtet). Dazu wird je, Patient und Messgrasse der MaximalMonat bestimmt. Sollte obige Hypothese zutreffen, díann müsste der 2. und 3. Monat vermehrt: als der "Monat mit maximaler Messung" bezeichnet werden. Andernfalls müsste man nur in 217 der Fälle (28,5%) den Maximal-Mo

nat als 2. oder 3. Monat bcobachten, in 5/7 der Fälle (71.5%) als cinen Jer anderen. Solange cin positiver Trend besteht, verschieben sich diese Ann.~-hmen zu Gunsten der NuIlhvpothese (keine Häufung im 2. und 3. Monat. _Jer Anteil in diesen Monaten wäre geringer). Dies ist cine eher konserva~~~e Verzerrung, und daher im Sinne des Tests zulässig. Die beobachteten Trends waren, soweit sie statistisch auffällig waren, immer positiv (Tab. 4); der -est kann also angewandt werden.

Da parallel 13 verschiedene Parameter auf Veränderung in der Zeit getc~-,et werden, musste das Pro-Studie-Signifikanzniveau (das Si2mfikanzni,---au wurde auf a= 0,05 festacicit

g ) entsprechend auf UA = 0,05113 = 0.0038-1 rigiert werden (nach Bonferroni-Holm).

Tab. 5. Relative Steigerung von Ausgangswert pro Monat (sortiert nach Signifikanz)

Tab. 6. Relative Steigerung von Ausgangswert pro Monat unter Berücksichtigung etwaiger Effekte im 2. oder 3. Monat, einseitiger Test für H₀ b_Trend>=0

Tab. 7. Test auf gleichmässige Verteilung der Monate mit der maximalen Messung

Ergebnisse

Das periphere Blut von 23 nichtselektionierten Patienten mit unterschiedlichen Tumorentitäten und deuflich differierenden Lcmphozytenzahlen wurde über einen Zeitraum von 7 Monaten dur-zhflusszytometrisch differenziert. Die Verteilung starker Lokalre~aktionen zeigte keine Abhängigkeit von der Zahl peripherer CD4-, T-Zellen (Tab. l). Tendenziell konnten jedoch bei den Patienien mit einer höheten Anzahl peripherer CD4+ T-Zellen auch höbere Konzentrationen appliziert werden als bei den Patienten mit niedrigerer Zellzahi.

Geprüft werden sollte, ob es einen generellen, zeitlich konstanten
Trend (flT,~nd: Steigerung oder Senkung) in den Messgrössen !eíbt
bzw. ob es einen flT,,,,d und/oder eine darüber hinausp-ehende Ver
änderung im 2. Monat (fl2monat) oder im 3. Monat in den
Messgrössen gibt. Wie in Tabelle 5 dargestellt, konnte für den --kn


Icil der Lympítozyten und die Zahl der NK-Zellen ein signifikanter Trend zur Vermeltrung beobachtet werden, wobei der Anteil der Lymphozyten um rund 2,1 % pro Monat und die Zahl der NKZellen um rund 5,8% pro Monat anstiegen (dies gilt für den Zeitraum 0 bis 7 Monate). Für die Anzahl der Lymphozyten, insbesondere die der CD4+ T-Zellen, CD28- CDS+ Zellen, CD28+ CDS+ Zellen, CD19+ B-Zcllen, sowie den Anteil der CD25+ T-Zellen zeigte sich cin statistisch auffälliger Trend, der aufgrund des multiplen Testproblems der Statistik nicht als signifikant bewertet werdej~_durfte. Füt- den prozentualen Anteil an LympItozyten konnte

signifikant aus9eschIossen werden, dass es im Mittel zu einem Abfall kommt, wältrend für die 6 weiteren Parameter zumindest ein statistisch auffälliger positiver Trend auffiel. Die Zah] der Leukozyten wies als einzige Messgrösse cinen negativen Trend auf.

Tabelle 4 gibt die Ergebnisse der ScItätzung eines zusätzlichen Effekts im 2. und im 3. Monat nach Therapiebeginn für die einzelnen Messgrössen wieder. Die Spalte "Prob > F" enthält die Signifikanz der Null-Hylpothese HO. Es konnte gezeigt werden, dass es weder im 2. noch im 3. Monat zu einem über einen allgemeinen Trend hinausgehenden Anstieg der Parameter kommt.


Die These. dass es innerhalb der ersten 2 Monate nach Therapiebeginn zur zablenmässigen Vermehrung definierter Subpopulationen kommt, führte zu einem einseitigem Test, bei dem nur geprüft werden sol], ob PTV,,d 2t 0 iSt- Mit Ausnahme der Leukozyten haben wir nur posítive Trends beobachten können. Das Unberücksichtigtlassen etwaiger positive Effekte im 2. und 3. Monat, auch wenn diese hier nicht signifikant waren, würde die Trendschätzung nach oben (ins positive) verzerren. Daher soll für diese Analyse Modellansatz 2 betrachtet werden. Die Signifikanzen dieser Fragestellung ergeben sich dabeí (bei positivem Trendschätzer) als die

HäIfte der p-Werte in Spalte "Prob > ITI" der Tabelle 6 (Kategorie: % pro Monat). Für den Schätzer der Leukozyten (negativer Trendschätzer) beträgt dieser 1 minus der HäIfte des p-Werts in Spalte "Prob > ITI".

Da durch die obigen Berechnungen kein statistisch ausreichender Beweis für die Hypothese gefunden wurde, dass es im 2. oder 3. Monat nach Therapiebegirin zur Vermehr-ung definierter Subpopulationen kommt, sollten je Patient die Monate mit der maxima


]en Nlessung untersucht wcrden. Wie in Tabelle 7 dargestellt, zciqte sich für die Anzahl der NK-Zellen, CD19+ B~Zellen. CD4+ T-Zellen und CDS+ Zellen (insbesondere CD28+ CDS+ Zellen) cine statistisch auffällige Häufuna der Maximal-Messungen in den Monaten 2 oder 3. Unter Berücksichtigung des multiplen Testproblems müssen diese Beobachtungen als statistisch auffällig bezeichnet werden.

Wie in Abbildung 1 dargestellt, ergaben sich jedoch deutliche interindividuelle Unterschiede in den Reaktionen definierter Immunparameter. Reaktionsoptirna (definiert als Vermehrung CD4+ T-Zellen) liessen sich zwischen 2 und 4 Monate nach Beginn der Misteltherapie beobachten. Insbesondere Patienten mit höhcrer Zahl peripherer CD4+ T-Zellen (> 800 Zellen/ptl) zeigten

cine Vermehruna der CD4+ T-Zellen. Die Patienten mit reduzierter Zahl peripherer CD4+ T-Zellen (- 400 Zellen/[il) wiesen gerinae Modulationen der peripheren Lymphozyten auf Unklar ist, ob hier cine weitere Dosissteigerung möglicherweise nicht doch zur Vermehrung der Subpopulationen geführt hätte - dies war jedoch aufgrund ausgeprägter Lokalreaktionen insbesondere bei den Patienten mit reduzierter Zellzahl nicht möglich. In allen Fällen waren bei kontinuierlicher Tlerapie passagere "Gegenregulationen" (rückläufige Zellzah1) zu beobachten. Eine Immunsuppression liess sich auch bei ML-Konzentrationen > 1 ng/kg KG nicht nachweisen. Die physiologischen Reaktionen gegenüber dem Antigen "Mistel" waren jedoch individuell unterschiedlich und nicht vorhersehbar.


Dískussion

Untersuchungen zur Entwicklung lymphozytärer Subpopulationen von Tumorpatienten nach subkutaner VAL-Injektion beziehen sich zumeist auf einen Beobachtungszeitraurn von wenigen Stunden [19-221 bzw. 2bzw. 3-Punkt-Messungen nach 4- bzw. 12wöchiger Therapiedaucr [11-16, 231, wogegen Untersuchungen unter praxisnälteren Bedingungen, also auch längerfristige und kontinuierliche Beobachtungen, bisher nicht vorliegen. M der Untersuchung der Lytnphozytenwerte von 23 nichtselektionierten Tumorpatienten mit unte rschiedliche n Tumorentitäten und deutlich differierenden Basiswerten der Lympbozyten konnte während des 7monati-en Beobachtungszeitraunts im Gesarnl:koilektiv eine statistisch -esicherte anteilmässige Vermeht-ung der Ly1mphozyten und der Zahi der NK-Zellen beobachtet werden, wobei. umgerechnet auf den NIL-Gehalt im Gesamtextrakt, zum Teil > 5 no NIL/kg KG verabreicht wurden. Ein statistisch auffälliger Trend fand sich ebenfalls für die Zahl der Lymphozyten-Subpopulationen (CD4+ T-Zellen, CD28- CDS+ Zellen, CD28+ CDS+ Zellen. CD19+ BZellen) und den Anteil CD25+ T-Zellen. Diese Ergebnisse sind konsistent nlit den von Beuth et al. [14] beobachteten Reaktionen peripherer Lymphozyten nach 4wöchiger Misteitherapie. Sie beschrieben die subkutane Behandlun.c, von 40 Patientinnen rnit Brustkrebs (Stadium IPIV) mit NIL-1 bzw. einem auf M1- 1 standardisierten VAL-Extrakt in einer Dosierung von 1 na kg KG. Hierbei karn es bei je 10 der Patienten zum signifikanten Anstieg der CD4+ T-1-lelfer/Induktor-Lymphozyten, der NK-Zellen und der CD25+ T-Zellen [14]. In einer anderen Untersuchune, der Arbeitsgruppe wurden 68 Patientinnen mit Brustkrebs (Stadium 111IV) mit dem auf NIL-I-standardisierten VAL-Extrakt (1 ng/kg KG) behandelt. Hierbeí konnten jedoch 6 und 12 Wochen nach Beginn der subkutanen Misteltherapie keine signifikanten Veränderungen lympbozytärer Subpopulationen fest-estel1t v~erden [231. Auch M Gliorn-Patienten, die zusätzlich zur destruktiven Standardtherapie einen auf NIL-1 standardisierten VAL-Extrakt injiziert bekamen. konnte im Vergleich zur Kontrollaruppe (n = 13) während eines 6monatigen Beobachtungszeitraums lediglich nach 3 Monaten si-nifikante Untersehiede für die T-Zellen (CD4+ und CDS+) und CD25+ T-Zellen in der VAL-Gruppe (n = 13) festgestel1t werden í491.

Aus Voruntersuchungen [14, 501 war zu vermuten. dass es trotz deutlicher interíndividueller Reaktionsunterschiede bei den Tumorpatienten innerhalb von 4-8 Wochen als Reaktion auf das An tigen "Mistel" zur Vermehrung definierter lymphozytärer Subpo pulationen kornrnt. Zu vermuten ~e, dass eine zu envartentit Immunstimulation im Sinne einer Vermehrun- definierter Lymphozyten-Subpopulationen nur in diesem Zeitraum auftritt und irp späteren Verlauf aufgrund einer Toleranz gegenüber dem Antigeri "Mistel" keine weíteren Reaktionen nachweisbar sind. Dies konnte auf Basis der vorliegenden Daten für das inhomogene Patientenkollektiv nicht bewiesen werden. Dennoch zeigte sich eine statistisch auffällige Häufigkeitsverteilung der Maxirnal-Monate für CD19+ B-Zellen, CD4+ T-Zellen, CD8+ Zellen, CD8+ CD28~ zytotoxische Zellen und CD16+/CD56+ NK-Zellen im 2. und 3. Monat nach Tberapiebeginn, wobei es im Beobachtungszeitraum bei adäquater Dosiseskalation zu einer Vermehruna der Lyrnphozyten-Subpopulationen kam. Zudem zeigte sich. dass insbesondere Patienten mit normaler bzw. höherer Anzahl von CD4T-Zellen deutlich reagibler hinsichtlich einer zahlenmässigen Vermehrung der CD4+ T-Zellen waren als Patienten mit reduzierter Zellzahl. Die Dosis des VAL-Extrakts konnte bei erst!zeriannten Patíenten zudem deutlich stärker gesteigert werden (>5 ne NIL/kg KG, berechnet aus ML-Gehalt im Gesamtextrakt), ohne dass es zu einem Rückgang der Zellzahl gekommen wäre. Von Bcuth el al. [15] wurde postuliert, dass es M einer DosisüberschreitunQ > 1 ng ML-I/kg KG zur Irnmunsuppression komrnt [15]. In der diese H-, pothese belegenden Untersuchung wurden jedoch selbst bei subkutaner Applikation von 5 ng ML-I/kg Maus ausser einer leichten Reduktion der Peritoneal-Makrophagen keine signifikanten Anderungen im Vergleich zu den Kontrollwerten hinsichtlich Thyrnusgewicht, Anzahl und Verteilung der Tbymozyten-Subpopulationen, Anzahi peripherer LYrnphozyten, Monozyten und Granulozyten sowie der Aktivierungsmarker-Expression auf Ls-rnphozy ten und Monozyten/Makrophagen gefunden.

Ziel der hier vorgestellten Arbeit war es zu überprüfen, ob die subkutane Misteltherapie in üblicher Dosissteigeruna zur Immunsuppression oder Immunstimulation, ausgedrückt als signifikante Reduktion oder Vermehrun- definierter Populationen, führt. Eine Immunsuppression konnte jedoch nicht nachizewiesen werden. vielmehr karn es im Beobachtungszeitrautn bei adäquater Dosiseskalation zur Vermehí-una definierter Lymphozytert-Subpopulationen, Ob diese Reaktionen auch von Minischer Relevanz sind, muss geprüft werden.

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