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| English version American Journal of Therapeutics, 5, 181-187 (1998) Infiltraciones subcutáneas inducidas por la inyección de extractos de muérdago (Iscador) Por Robert W. Gorter (1,2), Madelon van Wely (1), Matthias Stoss (1) and Uwe Wollina (3)
Auspiciado por la Sociedad de Investigaciones Oncológicas e Inmunológicas. Dirección Postal: Instituto de Investigaciones Oncológicas e Inmunológicas, Hardenbergstrasse 19, D-10623, Berlín, Alemania. Iscador, un extracto acuoso de Viscum album L., ha sido muy utilizado como droga contra el cáncer durante varias décadas. Las lectinas de muérdago tienen la capacidad de activar mecanismos de defensa no específicos, y la interacción lectina-carbohidratos puede verse involucrada en la inmunomodulación de aplicación clínica. Durante el tratamiento con extracto de plantas enteras de muérdago, al principio de la terapia, la zona de inyección presenta una reacción inflamatoria. Dichos sitios de inyección han sido sometidos a un examen histológico. Siete personas recibieron tres inyecciones subcutáneas de Iscador QuFrF o Iscador Qu Spezial (dos dosis de 0,1 mg. y una dosis de 2,5 mg) durante 9 días. Según el examen de biopsia de piel, todos los sujetos presentaban una epidermis normal. Las regiones dérmica y subcutánea contenían un denso infiltrado perivascular de linfocitos y presentaban un aumento de monocitos. No fue posible documentar ningún aumento de células plasmáticas, eosinofilos, mastocitos, neutrófilos o granulocitos, como sucedería en el caso de una infiltración granulomatosa. En la sangre, observamos un aumento significativo de los neutrófilos y monocitos 24 hs. después de la administración de 2,5 mg. de Iscador. Palabras clave: infiltración linfomonocítica, Iscador, muérdago, piel, histología inmunológica. INTRODUCCION Durante más de 80 años, un extracto acuoso de Viscum album L., denominado Iscador, ha sido utilizado como droga contra el cáncer. La patente que posee esta droga le permite ser utilizada para terapia anti cancerígena única o complementaria en Suiza, la Unión Europea y diversos países alrededor del mundo. V. album L. , el muérdago europeo, es una planta hemiparásica que crece en diferentes árboles hospedantes. (1) En 1920, Rudolf Steiner (1861-1925), fundador de la medicina antroposófica, opinó que el V. album L., podría mejorar los mecanismos de defensa del sistema inmunológico y prevenir o superar el crecimiento del tumor. Generalmente, Iscador se suministra de manera subcutánea dos veces por semana durante varios años. La piel y las membranas mucosas contienen diversos elementos del sistema inmunológico, denominado sistema inmunológico de la piel o tejido linfoide asociado a la piel, en el cual los antígenos que penetran sensibilizan las células linfoides dentro del tejido. Su penetración inicia una respuesta inmune a los antígenos externos o a sustancias que semejan antígenos para destruir los organismos infecciosos y neutralizar y eliminar tanto las toxinas potenciales como el tejido dañado. En forma regular, en el sitio de inyección al principio del tratamiento, el Iscador produce una reacción inflamatoria. Esta reacción es dosis-dependiente, es decir que mayores dosis producen reacciones locales más frecuentes y más fuertes. (8) Normalmente, las reacciones desaparecen luego de varias semanas de terapia. Los estudios practicados en roedores muestran que las responsables de la inflamación son las sustancias que contiene la preparación de muérdago, y no una contaminación bacteriana. (9,10) Estas reacciones inflamatorias locales son causadas probablemente por las lectinas del muérdago. (11) En otros estudios histológicos de pacientes individuales con melanoma maligno metastásico y gonartrosis se observó la presencia de infiltraciones subcutáneas que contenían linfocitos, monocitos y eosinofilos luego de ocho inyecciones subcutáneas de una preparación de muérdago (Plenosol). (12,13) Dichos descubrimientos sugerían que la reacción local observada podría ser de origen alérgico. Sin embargo, nuestra experiencia clínica señala que esta fue una reacción inflamatoria y no una reacción alérgica. El estudio inmunohistológico aquí descripto comenzó con la intención de documentar las respuestas subcutáneas al Iscador a fin de de lograr una comprensión mayor de las reacciones descriptas. Se examinaron las características de la infiltración inducida de Iscador en siete sujetos sanos. Además, se determinaron los niveles de células de sangre periférica antes y después de suministrar Iscador. MATERIALES Y METODOS Iscador A los fines de éste estudio se utilizó Iscador QuFrF (nueva droga en estudio) e Iscador Qu Spezial (Institut Hiscia, Arlesheim, Suiza) en ampollas de 0,1 ml. y de 0,1 y 5 mg. , fabricadas especialmente para esta prueba. Ambas preparaciones son extractos acuosos de plantas de muérdago que crecen en los robles. (14) La etapa inicial de su fabricación es igual, pero Iscador Spezial es sometido a una fermentación controlada, mientras que Iscador Qu FrF permanece en estado de no fermentación. Los lotes de Iscador utilizados son estandarizados en base a su contenido de lectinas de muérdago y viscotoxinas. La concentración de lectinas y viscotoxinas en estos preparados ha sido determinada a través del ensayo de las lectinas unidas a enzimas y de una cromatografía líquida de alto rendimiento (15,16) como se muestra en la tabla 1. Estas preparaciones de muérdago también contienen otras sustancias diversas, incluyendo aminoácidos, polisacáridos, y lípidos. (17) Los voluntarios y los procedimientos Se eligió a siete voluntarios no fumadores al azar, cuatro hombres y tres mujeres, entre 24 y 44 años con marcas de rendimiento Karnofsky de 100, y quienes prestaron su consentimiento expreso para recibir dosis de Iscador QuFrF (n=4) o Iscador Qu Spezial (n=3). Se les suministró inyecciones subcutáneas con agujas de 0,45 x 12 mm. tamaño 26 de 0,5 pulgadas (Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania) en el cuadrante superior derecho del área musculus gluteus maximus de acuerdo al cronograma mostrado en la Tabla 2. Entre veinticuatro y veintiséis horas luego de administrar los 2,5 mg. (0,5 ml 5,0 mg. ) de Iscador, se tomaron dos muestras de biopsia elípticas (de 5 mm x 10 mm de diámetro [w]). Se utilizó Lidocaina (Xilocane) 0,5 % con adzenalina 1: 10.000 (Astra Chem, Wedel, Alemania) como anestesia local. No se realizó ningún control. Se conservó una muestra de tejido en una solución de 4,5% de formalina y la segunda muestra en NaC1 estéril de 0,9%, a 4’C. Este estudio fue aprobado por el comité de ética a cargo. Inflamación Localizada Al décimo día, las características superficiales de la reacción inflamatoria local eran: su tamaño, el equivalente al del área del eritema, e inflamación y endurecimiento, así como aumento de la temperatura (caliente al tacto). Se preguntó a los sujetos acerca de si sufrían molestias por picazón o sensación de dolor en el sitio de la inyección y acerca del momento en que había aparecido cada una de ésas reacciones. Procedimientos Inmunohistoquímicos Los siguientes anticuerpos se utilizaron para la muestra conservada en formalina, de acuerdo con el enfoque del complejo peroxidasa-avidina-biotina (18,19): marcador linfocítico LCA (Dako, Hamburgo, Alemania; CD45), marcador celular B L26 (Dako; CD20), marcador celular T UCHL1 (Dako; CD45R), y marcador macrófago CD68 (Dako). Para las muestras nativas (conservadas en NaC1 0,9%), se utilizaron la interleukina-2 anti humana (IL-2), el receptor CD25 (Dako), CD38 (Becton Dickinson, San José, CA), y el receptor de transferencia CD71 (Dako). Investigaciones de Laboratorio Se tomó sangre venosa (vena cubital) de todos los sujetos como línea de base (dos extracciones el primer y tercer día) y el día de la biopsia (día 10). Los valores de base fueron determinados de acuerdo al promedio de los valores del día 1 y 3. Luego de lisar los eritrocitos, se evaluaron las células mononucleares de la sangre periférica en busca de la presencia de los marcadores superficiales elegidos. Se descubrió la presencia de linfocitos Total B, linfocitos T, y células CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD3+/CD25+, y CD8+/CD38+ por inmunofluorescencia directa, mediante la utilización de anticuerpos monoclonales (Becton Dickinson) y citometría de flujo (FACScan; Becton Dickinson, Sistemas de Inmunometría). De las mismas muestras de sangre (Sysmex E-5000/100; Sysmex; Langenfeld, Alemania) se obtuvo el total y la diferencia de leucocitos, y se calculó la cantidad absoluta de linfocitos en cada subgrupo. Asimismo se realizó el cálculo diferencial de sangre en forma manual dos veces. Análisis estadístico Para los análisis estadísticos se utilizó el examen-t, de pares relacionados utilizado para los estudios. Se consideró la importancia de los valores p< 0,05. RESULTADOS Biopsias La primera señal de una reacción local sucedió entre 1 y 10 horas después de la última inyección. Se observó un área eritematosa de suave a moderada (W, 2-5 cm). Se encontró endurecimiento e hinchazón en todos los sujetos entre 2,5 y 7 horas, y sensaciones de dolor entre 1 y 7 horas luego de la inyección de Iscador. Ninguno de los sujetos sintió picazón. En todos los casos existió un aumento de la temperatura al tacto localizada en la zona de reacción. A nivel histológico, todas las muestras de biopsia mostraban un epitelio de superficie normal. La epidermis no se vio afectada. Tanto el corio como el tejido graso subcutáneo mostraban una infiltración celular linfoide superficial, profunda y densa. Esta infiltración estaba formada por los típicos linfocitos con escaso citoplasma. No se registró aumento de las células plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos o mastocitos. En todas las muestras de tejido, la infiltración se componía de una densa concentración de células. En comparación, las infiltraciones de los sujetos D18 y E18 estaban ligeramente menos pobladas de linfocitos. En el plano inmunohistológico, la infiltración contenía un 60% de linfocitos LCA positivos. Todos los linfocitos reaccionaron al marcador de célula-T UCHL1.El 50% de los linfocitos eran CD4+, y el otro 50% eran CD8+. Ninguna de las células reaccionó al marcador de célula B L26. El resto de las células respondieron al marcador macrófago CD68. En las muestras de tejido nativas, casi todas las células linfáticas reaccionaron con el receptor IL-2- (CD25). En cuatro muestras, el 95 % de las células contenía el receptor marcador de transferencia (CD71). Mientras que en tres muestras (sujetos D16, D18, y E19) solamente entre el 50% y el 80% de las células reaccionaron al anticuerpo contra el receptor de transferencia (Tabla 3). En seis de siete muestras, en áreas más profundas de la infiltración, el anti-CD38 reaccionó casi con el 80% de las células. A nivel más superficial, se halló una expresión de CD38 del 80% en muestras obtenidas de tres sujetos. En las muestras de los otros cuatro, CD38 se expresó solamente en el 30% de las células (tabla 3). DISTINCION DE CELULAS SANGUINEAS PERIFERICAS En los siete sujetos, se observó un marcado aumento en la cantidad absoluta de células neutrofílicas y monocitos comparado con la línea de base luego de la última inyección de Iscador el día 10 (tabla 4). Los aumentos del promedio de ambos, células neutrofílicas y monocitos (3225 a 8514 y 390 a 706, respectivamente) fueron significativos a nivel estadístico (p< 0,001) (tabla 4). La cantidad de linfocitos disminuyó en todos los sujetos excepto en uno, y la disminución promedio fue significativa a nivel estadístico (p<0,05) (tabla 4). No hubo cambios en eosinófilos o en los totales de células-B. Las cantidades absolutas de células CD4+ disminuyó en seis sujetos, y las cantidades absolutas de células CD8+ así como la cantidad de asesinos naturales disminuyó en cinco sujetos. Es interesante destacar que las cantidades absolutas de los dos subgrupos de células-T (linfocitos CD3+/CD8+ y CD8+/CD38+) aumentaron levemente en cinco sujetos. DISCUSION En este estudio demostramos que, luego del suministro de 2,5 mg de Iscador QuFrF o Iscador Spezial, se induce una infiltración linfomonocítica subepidermal en el sitio de la inyección. En la superficie de la piel, apareció un eritema local, seguido de hinchazón y endurecimiento en un tiempo aproximado de 4,5 horas. Nuestros exámenes histológicos muestran que la epidermis era normal en todas las muestras. Sin embargo, las regiones dermal y subcutánea de la piel contenían una densa infiltración perivascular de linfocitos. Esta infiltración estaba localizada principalmente en el subcutis y representaba aproximadamente el 60% de los linfocitos T, con la misma distribución de células CD4+ y CD8+ (proporción CD4:CD8 = 1). El 40% restante de las células de la infiltración se identificaron como macrofagas. Ninguna célula reaccionó a los anticuerpos contra L26, por lo tanto, se descartó la presencia de células B. Debe aclararse que no estaba involucrada la epidermis, tal como se observó a través de las pruebas de alergia mediante aplicaciones intracutáneas de antígeno (20). Además, no hubo aumento en células plasmáticas, eosinofilos, mastocitos, neutrofilos o granulocitos, como ocurre en el caso de una infiltración granulomatosa. En piel normal, se sabe que los linfocitos dérmicos constituyen el 90% de la cantidad total de linfocitos-T (4). Puede encontrarse pequeñas cantidades de linfocitos T en la dermis reticular superior y alrededor del 2% del total de linfocitos se encuentran en el tejido conectivo. En la piel normal, no se observa la presencia de células B (3,4). Es importante destacar que casi todos los linfocitos T en cada biopsia expresaron el marcador receptor IL-2 (CD25). La mayoría de las células de la infiltración expresó el marcador de transferencia (CD71), que normalmente está presente en las células en proceso de proliferación y en macrofagos. Además, el 80% de las células de las capas subcutáneas eran CD38+ en todos los sujetos. CD38 se expresa a través de los linfocitos T activados y macrofagos (células presentadoras de antígenos). El incremento en los marcadores de activación indica un aumento en la producción de citokina de los linfocitos y células monocíticas que los expresan (21,22). A través de estas observaciones, podemos concluir que el suministro de ambos, Iscador QuFrF e Iscador Qu Spezial produce una activación de linfocitos CD4+ y CD8+. Estos resultados confirman observaciones anteriores con respecto a las células mononucleares sanguíneas periféricas de individuos sanos y de individuos con virus positivo de inmunodeficiencia humana en tratamiento con Iscador (14). Todos los valores de células sanguíneas se mantuvieron dentro del mismo nivel. Se observó una disminución en los linfocitos CD4+ y CD8+ y en las células asesinas naturales, aunque este dato no fue significativo a nivel estadístico. Se observó claramente un aumento significativo (p< 0.001) en la cantidad de células neutrofílicas y monocíticas. Queremos señalar que la sangre de los siete sujetos fue extraída en el mismo momento del día, con una variación de hasta 2 horas. Es posible que la variación diaria intrapersonal pueda explicar en parte el cambio observado en la cantidad absoluta de células. Sin embargo, fue significativo el triple aumento en la cantidad de células neutrofílicas. Este resultado concuerda con observaciones anteriores en las cuales, luego de una única aplicación intravenosa de Iscador, se describían aumentos significativos de 2,7 a 3,2 veces los valores básicos (23,24). Según nuestro conocimiento, nunca se ha descripto anteriormente un incremento en las células monocíticas durante el tratamiento con Iscador. Nuestros resultados muestran que la reacción local observada no es una reacción alérgica, sino una reacción inflamatoria no-específica a modo de reacción en una fase posterior. Esta inflamación local lleva a la activación de los componentes específicos y no específicos del sistema inmunológico. La activación específica se expresa a través de un aumento de los linfocitos CD25+ y CD71+ en el sitio de aplicación. Además, se observó un aumento en las células activadas en la sangre de la periferia, lo que concuerda con observaciones anteriores.. (14) La diminución de los linfocitos T en la sangre periférica podría interpretarse como indicador de la migración de esas células hacia la piel. El aumento significativo de los neutrófilos es una reacción no específica inducida por la reacción inflamatoria a la administración de Iscador. Se planea realizar nuevos estudios a fin de estudiar más profundamente estas observaciones. Se sabe a través de experimentos in vitro e in vivo que las lectinas del muérdago estimulan la secreción de necrosis tumorales factor alfa por parte de los monocitos, y estimulan la secreción de IL-1, IL2 e IL6 (24-28) de las células sanguíneas periféricas mononucleares. La liberación de IL-2 de las células mononucleares in vivo luego de suministrar Iscador ha sido descripta en diversos estudios (25,26). En el modelo Piel 2, un bioensayo de piel humana in vitro, se observó una clara estimulación de la liberación de IL-1 e IL-6 24 hs. luego de la incubación con extracto normalizado de muérdago (29) de lectinas de muérdago –1 (ML-1). Además, los estudios realizados con pacientes con cáncer mostraron un aumento significativo de IL-6 en el suero sanguíneo en las primeras 6 hs. luego de la aplicación de Iscador (27). Por consiguiente, se estima que la inyección de Iscador en la piel induce la liberación de IL-1, IL-2 e IL-6. Si esto es así, los pacientes atacados por este tipo de leukinas podrían desarrollar reacciones locales similares. Sin duda, en diversos estudios se ha descripto reacciones análogas. La aplicación subcutánea de IL-2 en pacientes con condición atópica y en sujetos sanos, indujo una reacción eritematosa luego de 24 a 48 hs. En este estudio, se observó un claro aumento en la expresión de los marcadores de activación CD25 y HLA-DR+. La respuesta celular a esta única inyección de IL-2 mostró una infiltración compuesta de células linfomonocíticas y granulocitos neutrofílicos (28). Luego de la inyección subcutánea de alfa IL-1 (10 y 60 U), se observó una gran reacción eritematosa luego de pasadas entre 6 y 9 horas, y dicha reacción duró al menos 24 horas. Tal como se ha descripto en el caso de la infiltración inducida IL-2, la infiltración linfomonocítica posteriormente contuvo granulocitos neutrofílicos (30). Debemos señalar que no observamos neutrofilos en nuestra infiltración linfomonocítica. En pacientes con condición atópica se observó que, luego de la amenaza del antígeno, se producía IL-6 en el sitio de la inflamación. Se observó una interesante relación entre la liberación de IL-6 en las primeras 6 horas luego de la amenaza del antígeno y el tamaño del área eritematosa, así como la relación entre IL-6 en las 6 posteriores y el influjo de eosinofilo en la infiltración (31). Otro estudio acerca de la liberación de citokina a través de la hipersensibilidad de tipo retrasada inducida con tuberculina descubrió, además de IL-1 e IL-6, un incremento en la liberación de necrosis tumoral factor alfa. Aquí, la infiltración mononuclear observada estaba compuesta principalmente de monocitos (32). Consideramos a la infiltración local observada en nuestro estudio una reacción de fase tardía Las reacciones inducidas por Iscador parecen ser muy similares a las reacciones a la inyección de IL-1, IL-2 e IL-6 descriptas. Sin embargo, no observamos un incremento en la cantidad de neutrófilos en nuestra infiltración linfomonocítica, lo cual se ha descripto luego del suministro de IL-1 o IL-2, ni detectamos eosinofilos en la infiltración, como se ha descripto luego de la aplicación de lL-6. No está claro para nosotros por qué en el estudio con Plenosol, luego de ocho inyecciones subcutáneas en un paciente con melanoma y uno con gonartrosis, se observó un fuerte influjo de eosinofilos en la infiltración (12,13). Sugerimos tres explicaciones posibles que deberían ser analizadas más profundamente: (1) la proporción lectina/viscotoxina en los diferentes preparados de muérdago inducen reacciones diferentes; (2) la reacción local será diferente luego de cantidades diferentes de inyecciones o (3) la reacción del sistema inmunológico inducida por el extracto de muérdago en sujetos sanos es diferente de aquella en pacientes enfermos. No fue posible documentar diferencias obvias entre los efectos de Iscador Qu FrF e Iscador Qu Spezial. Lo que fue claramente observado es que ambos, Iscador Qu FrF e Iscador Qu Spezial, provocan una reacción inmunológica característica, no específica inducida por un antígeno en personas sanas con una activación masiva de linfocitos T en el sitio de inyección. Se observó un aumento en las células activadas CD4+ y CD8+ y macrofagas. Ya ha sido informada anteriormente en derrames de melanoma (33) la activación de macrofagos por las lectinas de muérdago. A nuestro entender, este es el primer estudio realizado para describir la reacción de la piel al Iscador. Tabla 1 Concentración de lectinas y viscotoxinas en 2.5 mg de Iscador Qu Spezial e Iscador QuFrF
Tabla 2
Tabla 3
Tabla 4
AGRADECIMIENTOS Agradecemos a Arno Triebskorn por realizar las biopsias, a Helmut Laff por realizar los análisis histológicos, y a Maria Linder por su crítica del manuscrito.
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